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NGS工作流程步骤

新一代测序的主要步骤

新一代测序工作流程包括三个基本步骤:文库制备、测序和数据分析。了解每一步骤的基本知识以及如何规划您的NGS工作流程。

查看工作流程示例

NGS工作流程的准备工作

在进行新一代测序工作流程之前,先分离纯化核酸。某些DNA提取方法会引入抑制剂,这可能会对NGS工作流程中进行的单酶反应产生负面影响。为了获得最佳结果,请使用专门针对您的样本类型进行了优化的提取实验方案。RNA测序实验需通过逆转录将RNA转化为cDNA。

大多数NGS工作流程都需要在提取后进行QC步骤。我们推荐使用紫外分光光度法来评估纯度,使用荧光分析法进行核酸定量。

NGS工作流程的第1步:文库制备

文库制备对于成功进行NGS工作流程至关重要。该步骤会制备出兼容测序仪的DNA或RNA样本。通常会先对DNA进行片段化处理,然后再向两端添加特定的接头来构建测序文库。在Illumina测序工作流程中,接头含有的互补序列可以使DNA片段结合到流动槽上。随后再扩增和纯化片段。

为了节省资源,可以将多个文库混合在一起,在同一运行中进行测序——该过程称为多重分析。接头连接过程中,唯一标签序列(或说“条形码”)会添加到每个文库。这些条形码可以在数据分析过程中区分文库。

文库制备资源

查看文库定量和质量控制指南。

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了解如何在纯化DNA/RNA期间避免污染。

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NGS工作流程的第2步:测序

NGS工作流程的测序步骤需要将文库上样到流动槽然后置于测序仪中。簇生成过程会扩增DNA片段簇,生成数百万个单链DNA拷贝。大多数Illumina测序仪器可以自动生成簇。

在边合成边测序(SBS)过程中,化学修饰的核苷酸会通过天然的互补性与DNA模板链结合。每个核苷酸都有一个荧光标记和一个可逆终止子,后者可以阻止下一个碱基的掺入。荧光信号可以指示出加入的核苷酸种类,终止子被切割后,下一个碱基才可以继续结合。

读取正向DNA链后,read会被洗掉,随后重复该过程,读取反向链。这种方法称为双端测序。

NGS工作流程的第3步:数据分析

测序结束后,仪器软件会识别核苷酸(该过程称为碱基检出)并预测碱基检出的准确性。在数据分析期间,您可以将测序数据导入到标准分析工具或建立自己的流程。

如今,您可以使用直观的数据分析应用程序来分析NGS数据,无需进行生物信息学培训或另外雇佣实验室人员。这些工具可以进行序列比对、变异检出、数据可视化或解读。

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启动您的NGS工作流程

想要尽快开始?您可通过我们的Workflow Design and Evaluation Service咨询实验设计专家。*我们将帮助您设计合适的NGS工作流程,处理样本并生成您的第一个NGS数据集。

*亚洲和南太平洋国家/地区不提供此类服务。

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特色NGS工作流程

微生物全基因组测序

微生物全基因组测序可用于识别病原体、比较基因组以及分析抗菌素耐药性。我们的特色NGS工作流程描述了该应用每个步骤的推荐方法和产品。

使用提取试剂盒从微生物菌落中分离DNA,不能引入EDTA或酚:氯仿等抑制剂。采用紫外分光光度法评估纯度,用荧光分析法进行DNA定量。

按照Nextera DNA Flex指南中的实验方案制备文库并对其进行定量。您也可以使用Agilent 2100 Bioanalyzer或Advanced Analytical Fragment Analyzer进行文库质量检测。您需要使用:

预计手动操作时间:3.5小时
预计DNA起始量:1–500 ng

2 × 150 bp的测序文库按照MiSeq系统指南中的实验方案运行。您需要使用:

预计运行时间:~24小时
预计产出:4.5–5.1 Gb
每个运行的样本:多达16个微生物基因组

使用BaseSpace Sequence Hub中的SRST2 App进行数据分析。该应用程序会报告来自多位点序列分型(MLST)数据库的序列类型和来自序列数据库的参考基因。您可以指定使用哪些MLST和/或序列数据库来分析样本。您需要使用:

探索样本数据集: MRSA阴沟肠杆菌

深入了解微生物全基因组测序

特色产品

MiSeq系统
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通过MiSeq系统,您可以开展靶向重测序、宏基因组学、小基因组测序、靶向基因表达图谱分析等重点应用。

查看系统
Nextera DNA Flex Library Prep Kit
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一个快速、集成的工作流程,适合广泛的应用,从人类全基因组测序到扩增子、质粒和各种微生物。

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MiSeq Reagent Kit v3
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与较早的MiSeq Reagent Kit版本相比,优化的测序化学技术可增加簇密度和读长,并提高测序质量分值。

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NGS指南

了解NGS工作流程每个步骤的注意事项。

查看指南

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