TIF-Seq
TIF-Seq
转录异构体测序（TIF-Seq）选择性地对带有5’帽子结构和poly(A)尾巴的全长mRNA分子进行测序，从而确定转录异构体。用寡核苷酸替代5’帽子结构，选出戴帽子的mRNA分子。为了实现这一点，先去除不戴帽RNA的5’-磷酸基团，以便与它们对应的戴帽RNA分子相区分。之后利用烟酸焦磷酸酶（TAP）处理，去除帽子，暴露出5’-磷酸基团，以便与寡核苷酸连接。mRNA被分在两个不同的管中，并逆转录成全长cDNA（flcDNA）。每管中的flcDNA与带有条形码的5’-生物素化引物和3’-引物退火。引物包含每管特有的条形码序列，作为控制机制，防止嵌合片段和分子间连接。将两管混合，用NotI酶消化，以产生粘性末端，并连接形成环状的双链cDNA。之后这些双链DNA被片段化，且序列包含生物素化的3’和5’端，可通过链霉亲和素分离。多重条形码被加在已纯化的cDNA片段的3’和5’端，以形成测序用的cDNA文库。
优点：
- 通过测序同一条RNA链的5’和3’端，确定转录异构体
- 嵌合控制条形码过滤掉cDNA片段的分子间连接
缺点：
- 需要大量的全长RNA
- 利用NotI酶引入粘性末端只在富含AT的基因组（如酵母）中可行