绘制神经多样性图谱：小鼠初级视觉皮层神经元身份的分子分析

引言

美国未来学家、物理学家和作家加来道雄（Michio Kaku）曾写道："人脑有1000亿个神经元，每个神经元与另外10000个神经元相连。坐在你肩膀上的，是已知宇宙中最复杂的物体。"他的话毫不夸张。事实上，迄今为止，科学家甚至无法告诉我们，在一个相对简单的哺乳动物大脑（如小鼠）中可能发现多少种不同类型的神经元，更不用说人类大脑了。

艾伦脑科学研究所（Allen Institute for Brain Science）是一家独立的非营利性研究机构，致力于理解大脑的内部运作机制，正试图改变这一现状。博西尔卡·塔西奇（Bosiljka Tasic）博士是艾伦研究所细胞类型项目（Cell Types program）的研究员，她正在开发开创性的分子分析方法，分析单个神经元的转录组和表观遗传景观，以定义小鼠视觉系统中的神经元身份。她接受了iCommunity的采访，谈论了艾伦研究所的使命，以及利用因美纳测序系统进行单细胞测序如何改变神经元分类工作。

Q：艾伦脑科学研究所的使命是什么？

博西尔卡·塔西奇（BT）： 艾伦研究所的使命是加速理解人脑如何工作。为实现这一宏伟使命产生影响，我们正在研究信息是如何在构成小鼠大脑的多种细胞中进行编码和处理的。小鼠是最易获取的哺乳动物模型系统，且许多信息处理原理在哺乳动物中是保守的。我们的计划是通过研究小鼠视觉系统来定义基本的信息处理框架，然后将其与灵长类动物和人类进行比较，以理解什么是人类独有的。

为实现这一目标，我们拥有与标准学术实验室不同的组织架构和规模。我们将许多具有不同专长的科学家聚集在一起，以真正多学科的方式组织成重叠的团队。我们还将这些研究产生的原始数据作为百科全书式资源发布在我们的网站上，供学术界使用。我们最新的资源之一聚焦于小鼠初级视觉皮层（即V1或VISp）中的细胞类型，包括构成该脑区的单个神经元的基因表达数据、生理学和形态学信息。

Q：V1由哪些类型的细胞组成？

BT: V1是皮层中处理视觉信息的主要区域。我们对该皮层区域内细胞多样性的程度了解有限。我们知道主要类型：兴奋性和抑制性神经元，以及非神经元细胞，以及每个主要类别内的一些进一步细分。虽然皮层已被许多人研究过，但在单细胞水平上对细胞多样性及不同类型信息相关性的全面描述并不存在。大多数研究通常基于几个参数，而非高度多维的数据集。例如，如果你用三个基因对细胞进行分类，你可能会得到一幅图景。然而，如果你观察所有基因，你可能会获得非常不同的视角。

"利用单细胞mRNA测序，我们可以检测每个细胞中的数千个基因，并为每个细胞获得高度多维的数据集。"

Q：为什么单细胞转录组测序是这些研究的宝贵工具？

BT: 单细胞转录组测序具有优势的原因有几个。它是一种全基因组技术，意味着你可以分析细胞中表达的几乎所有基因（最佳近似）。它让你能够基于多个基因来观察细胞多样性。利用单细胞mRNA测序，我们可以检测每个细胞中的数千个基因，并为每个细胞获得高度多维的数据集。在此之前，人们最多只能基于几个基因来表征细胞。如果你恰好观察的是关键基因，那可能就足够了。然而，我们并不知道哪些基因是重要的。

Q：利用单细胞mRNA测序，您对V1神经元细胞有什么发现？

BT: 当我们开始单细胞mRNA测序研究时，我们并不知道会看到什么。我们从转基因小鼠的V1中收集了近1700个通过质量控制标准且具有良好测序信息的细胞。我们能够定义V1皮层区域中的49种类型，其中42种为神经元类型，7种为非神经元类型。在42种神经元类型中，我们发现大约一半是GABA能神经元，另一半是谷氨酸能神经元。

这种细胞分类分析的优点在于它是无偏的。当我们对这个单细胞数据集进行聚类和分解为群组时，我们对细胞来自V1的哪个位置（哪个细胞层和哪个转基因品系）是盲态的。我们进行了两种平行的聚类方法，然后进行了第三层验证分析，以确定在我们发现的基因表达特征下，每个单细胞能够被稳健地分类到某种类型的程度。我们基于已知或新的标志基因，事后分配兴奋性、抑制性或非神经元身份类型。

Q：您发现了一些被描述为"模糊"的聚类。这是什么意思，有什么含义？

BT: 在与我们的生物信息学家合作时，我希望能够检查我们获得的细胞类型的基因表达特征，然后询问每个细胞与这些类型的匹配程度。这项检查使用重复性机器学习方法，显示有时某些细胞会被分类到一个聚类中，有时又会被分类到另一个聚类中。我们称这些为"中间型"细胞，它们提供了一种在研究论文中通常看不到的视角。这些是具有模糊身份的细胞，在某些细胞类型中更为普遍。一些聚类被许多中间型细胞所"连接"。其他聚类则在这个多维基因表达空间中占据单一位置，与其他聚类之间没有任何中间型细胞。

这些数据表明，并非所有细胞类型都具有严格离散的身份。某些细胞类型可能无法明确区分，实际上可能是表型连续体的一部分。这对神经科学来说并不是一个陌生的概念，因为我们知道神经元可以响应活动或经验而改变，并具备在动物一生中修改其行为所需的塑性。

"利用新一代测序，我们发现了许多新的、此前未被发现的标志物，其表达随后我们通过替代方法进行了确认。"

Q：您以前使用什么技术来分析转录组？

BT: 我们并行进行了qRT-PCR和新一代测序（NGS）。然而，qRT-PCR的问题在于你并不总是知道要观察哪些基因。任何非全基因组方法的问题在于，你可能会花费大量时间选择基因，但仍然得不到正确答案。如果你不基于先前的全基因组知识来进行基因选择，你的选择就会有偏倚，无法提供完整转录组景观的良好代表性。

mRNA测序提供全基因组基因表达谱，使我们能够专门选择最能体现转录组景观中差异的基因。其中一些基因此前已知，但许多我们现在用作单个神经元类型最佳标志物的基因，在通过NGS发现它们之前我们并不知道。相反，我们使用的是文献中已有的基因——但许多基因没有被测试或检测到，因为每种方法都有其自身的灵敏度问题。利用NGS，我们发现了许多新的、此前未被发现的标志物，其表达随后我们通过替代方法进行了确认。

Q：您如何进行细胞分离？

BT: 细胞分离是一个重大障碍。成年活体神经元的分离很困难，因为成年神经系统组织不易解离为悬液。细胞高度互连，在细胞分离过程中，轴突和树突被撕裂，许多细胞无法存活。此外，为了获取某些稀有细胞类型，我们需要分析大量细胞。因此，我们决定使用转基因Cre品系作为细胞来源，其中特定细胞群被荧光蛋白标记。然后我们优化了制备成年大脑细胞悬液的程序，并建立了荧光激活细胞分选（FACS）用于单细胞分离。所有这些使我们能够分离那些稀有群体，因为我们可以比无偏方式更频繁地采样稀有细胞类型。因此，我们的细胞采样并非无偏的，而是我们有意从能够标记潜在稀有细胞类型的转基因品系中选择和分离细胞。使用这种方法，我们获得了极其可靠的单细胞分离。

BT: 我们在实验室中通过MiSeq系统进行相对浅度的测序来进行文库验证测序。然后我们将深度文库测序外包给几家拥有HiSeq系统的本地核心实验室。

"拥有内部的MiSeq系统使我们能够快速开发和改变我们的方法，并在将文库送往核心实验室进行HiSeq系统深度测序之前确认我们拥有良好的文库。"

Q：您为什么选择MiSeq系统？

BT: 我们需要一台内部快速周转的系统来进行文库验证，特别是在我们开发流程期间。拥有内部的MiSeq系统使我们能够快速开发和改变我们的方法，并在将文库送往核心实验室进行HiSeq系统深度测序之前确认我们拥有良好的文库。这对我们来说是一个很好的组合。

Q：您使用哪种文库制备试剂盒？

BT: 我们测试了几种方法，选择了Clontech的SMARTer，因为它能够可靠地扩增单细胞样本。对于我们的V1研究，我们使用了SMARTer Version 1。SMART-Seq 4现已上市，我们正在将其用于新研究。对于由SMARTer获得的cDNA的文库制备，我们使用了Nextera XT文库制备试剂盒。它使我们能够使用少量cDNA进行NGS文库制备，并跳过超声打断步骤。

"在拥有单细胞转录组分析之前，我们没有一种方法能够以无偏的方式对异质性组织进行分解并定义其中的分子类型。"

Q：您的测序运行参数是什么？

BT: 我们最初在测序深度上做得过头了，因为我们不知道需要多大的深度才能获得区分新细胞类型的良好分辨率。我们将早期单细胞样本的cDNA测序到约2000-3000万条读段，有时甚至更高。然后我们进行了读段子采样和计算机聚类，并确定对于大多数细胞来说，每个细胞获得500-1000万条总读段就足够了。

如果只是想区分神经元与非神经元以及兴奋性与抑制性细胞，这种深度是不必要的。对于那些研究，可以使用低得多的深度——每个细胞10万条读段或更少就足够了。然而，如果我们想区分相关的神经元亚型，以我们能够获得的细胞数量，我们肯定需要更深的测序。

Q：单细胞测序揭示了哪些其他方法无法让您看到的信息？

BT: 单细胞测序为细胞类型分类做出了贡献，而且不仅在皮层中。在拥有单细胞转录组分析之前，我们没有一种方法能够以无偏的方式对异质性组织进行分解并定义其中的分子类型。单细胞转录组学允许你在不先问"我需要使用哪些基因？"的情况下将组织分解为类型。相反，我们可以观察所有基因。

在单细胞测序之前，我们也不知道什么会构成不同细胞类型的合理全面索引。我们是在谈论数千种类型吗？数量级是多少？我们的研究表明，我们谈论的是大约50种不同的V1细胞类型，其中一些可能是模糊的。我不能声称我们的工作真正全面——可能还有我们未能识别的稀有细胞类型。因此，最终在这个脑区内可能还会有几十种更多类型。

最后，单细胞测序使我们能够定义特定于特定细胞类型的标志物。这对构建能够访问这些特定类型的工具具有巨大意义。现在我们有了配方；例如：基因A加基因B将使我们能够特异性地访问Z细胞类型。以前我们只是猜测。这些新工具将使我们能够定义不同细胞类型的功能，并研究它们在神经回路中的工作方式。

"比较来自不同皮层区域的单细胞mRNA测序数据，将使我们能够提出与细胞类型保守性和独特性相关的新问题。"

Q：您研究的下一步是什么？

BT: 我们的研究在某种程度上是一项试点研究。它向我们表明，我们可以对成年皮层细胞在明确定义的解剖区域中进行单细胞mRNA测序。我们现在想要分析其他明确定义的区域，特别是其他皮层区域。比较来自不同皮层区域的单细胞mRNA测序数据，将使我们能够提出与细胞类型保守性和独特性相关的新问题。

我们与一些外部学术实验室有几项合作，这些实验室正在采用我们的方法来对他们感兴趣的脑区中的细胞进行分类。利用这种技术，我们可以分解任何可能与V1功能截然不同的脑区。通过构建特定的遗传工具，我们可以询问在我们感兴趣研究的特定行为中某些细胞类型的功能是什么。这非常令人兴奋。

MiSeq 系统已停产。推荐使用MiSeq i100系统。

HiSeq 2500 系统已停产。NovaSeq X系列是推荐的替代方案。

Single-cell RNA sequencing

Nextera XT DNA Library Prep Kit

参考文献