Abstract
- 因美纳的5-碱基解决方案提供了一体化的端对端NGS文库制备和分析工作流程，可同时进行甲基化图谱分析和高度准确的遗传变异检测。
- 使用因美纳改造的酶将甲基化胞嘧啶（5mC）转化为胸腺嘧啶，同时保留未甲基化的胞嘧啶，这样可更大程度实现比对，并可从每个测序read获得5-碱基的A、G、C、T和5mC读数。
- 该工作流程包含不到一天的文库制备，以及不到一小时的标准因美纳测序和快速DRAGEN双组学二级分析，并且与目标富集兼容。
- 早期测试表明，因美纳的5-碱基解决方案提供了与市场上甲基化技术相当准确性的甲基化图谱分析，同时提供高度准确的遗传变异检测。
简介
DNA分子包含多层信息，包括基因序列和表观遗传修饰，因此本质上是多组学的。除四个典型核苷酸之外，还有第五个碱基：甲基化胞嘧啶（图1）。甲基化胞嘧啶是表观遗传标签，其作为动态分子信号来响应环境、发育和细胞因素以修饰基因表达。正如遗传变异能够揭示健康状况一样，异常的甲基化特征也可作为疾病的指示标志。相对于单组学研究，将遗传和表观遗传信息分层在一起可以提高分辨率和灵敏度，从而揭示新的生物学见解。
图1：DNA分子由5个碱基组成：A、C、G、T和甲基化C
市售的甲基化图谱分析方法（如亚硫酸氢盐或EM-seq）将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，从而从文库中去除大部分胞嘧啶，得到难以测序和比对的低复杂度基因组。然后从剩余的未转化胞嘧啶推断出甲基化胞嘧啶。尽管这些技术是塑造我们当前对DNA甲基化理解的基础工具，但它们缺乏足够的准确性来同时实现高分辨率的遗传变异检测。我们设想，一种能够从同一工作流程中检测两种变异类型的解决方案将大幅加速科学发现。
在此背景下，我们推出了一种创新的5-碱基解决方案，与替代方法相比，能够以快速、简单和全面的工作流程进行甲基化图谱分析和遗传变异检测（图2）。
图2：与交替的甲基化图谱分析或双组学文库制备和分析选项相比，因美纳5-碱基解决方案的周转时间更短
1.市售双组学产品：Füllgrabe et al.2023；市售酶制剂： Vaisvila et al. 2021（文库制备）和Bismark；亚硫酸氢盐：xGen Methyl-Seq DNA Library Prep Kit（2025年3月评估）；WGS：Illumina DNA Prep和DRAGEN预测序步骤包括定量、归一化和混合
新型解决方案
因美纳5-碱基解决方案的核心是一种全新的定制酶，由因美纳内部设计，可将甲基化胞嘧啶选择性直接转化为可用于测序的胸腺嘧啶（图3）。经过数百万次蛋白质变体的筛选和数代迭代，最终鉴定出一种对甲基化胞嘧啶具有最高选择性和反应效率的蛋白质，使得反应仅在30分钟内即可达到最佳性能。
图3：高选择性地将甲基化胞嘧啶（5mC）转化为胸腺嘧啶的新型工程酶
图4：甲基化C与C>T变异从DNA双链体中分离
工作原理
在基于高效连接法的文库制备工作流程中，甲基胞嘧啶转化反应是一个简单的整合步骤。该工作流程从提取、剪切的基因组DNA（gDNA）或无细胞DNA（cfDNA）开始，然后进行末端修复、加A尾和接头连接。接下来，将DNA变性并与5-甲基胞嘧啶转化酶一起孵育，即可在不到一小时内通过单次反应直接转化甲基化胞嘧啶。转化后，通过PCR扩增样本并进行磁珠纯化，用以在标准的因美纳测序平台上进行测序。文库制备流程大大简化，可在八小时内完成。转化试剂还可与高深度应用的靶向捕获富集兼容，包括基于UMI的误差校正。
测序完成后，只需一键式的分析流程，即可在一小时内完成比对、甲基化注释和变异检测。结果可以使用Illumina Connected Multiomics和Emedgene等解读软件进一步处理。
图5：5-碱基工作流程
高准确性的甲基化图谱分析，测序量更少
在基准研究中，5-碱基解决方案可提供甲基化图谱分析，其准确性与金标准甲基化转化方法相当。基于对甲基化和未甲基化pUC以及lambda对照基因组的评估，该化学方法实现了甲基化胞嘧啶的高转化率和未甲基化胞嘧啶的极低脱靶转化（图6A）。采用5-碱基解决方案测量人基因组中CpG岛的甲基化水平，与EM-seq转化法获得的结果高度一致。5-碱基的文库仅转换甲基化胞嘧啶，因此具有较高的可定位性，每个测序深度可覆盖更多的CpG位点（图6C），这意味着使用5-碱基解决方案具有更高的发现能力。
图6：与市场上的金标准甲基化测序化学技术相比，甲基化检测的准确度高、测序read序列更少
（A）因美纳5-碱基解决方案能够准确、专一地转化甲基化对照DNA（未甲基化lambda：0.5%、0.4%、0.9%；甲基化pUC19：亚硫酸氢盐、EM-seq v1和基于因美纳连接法的5-碱基转换方法分别为95.0%、96.4%、94.7%）（B）比较NA12878参考DNA中CpG岛的平均甲基化时，因美纳5-碱基与EM-seq高度相关（C）使用因美纳5-碱基与EM-seq v1转换方法从5亿个测序read对中捕获的CpG数量。2700万个CpG位点的5-碱基覆盖度为10倍，而EM-seq仅覆盖2200万个CpG位点。
高灵敏度的遗传变异同步检测
将未甲基化胞嘧啶转化为胸腺嘧啶的甲基化化学过程给遗传变异检测带来了挑战，如果需要遗传变异信息，通常需要单独处理标准测序文库。因美纳的5-碱基解决方案除了能在同一测序read内检测甲基化胞嘧啶外，还能在全部四个碱基位置（A、T、G和C）进行高分辨率变异检测，无需两个单独的文库制备。使用Illumina BaseSpace Sequencing Hub或Illumina Connected Analytics中的DRAGEN应用进行分析时，5-碱基解决方案可提供高度准确的小变异检出——包括生殖系和体细胞变异（图7A、7B）。此外，该技术还可与靶向捕获富集相结合，用于检测血液、新鲜冷冻组织或cfDNA中的低频变异（图7B）。
图7：DNA变异检测性能与标准WGS相当
（A）在使用NA12878进行生殖系SNV检测时，因美纳5-碱基解决方案的准确性与WGS相当（EM-seq和经Bis-SNP处理的亚硫酸氢盐测序数据，5-碱基和WGS数据均由DRAGEN分析流程处理）。（B）富集的低变异等位基因频率（VAF）SNV检测与富集和UMI折叠的标准WGS的比较
一次分析提供双组学信息，助力药物发现
因美纳的5-碱基解决方案是一种新颖的方法，旨在通过单一工作流程同时获取遗传和表观遗传信息。我们预期这一技术将有效增强在癌症、罕见病等广泛研究领域中的发现能力。利用单个read同时报告基因组和甲基化组状态的能力，可将致病突变与生殖系等位基因特异性甲基化联系起来（图8A）。我们还证实，5-碱基通过双组学分析从单个样本制备获得的基因组和甲基化特征成功解析了此类情况（图8B）。在因美纳，我们正持续探索如何通过整合双组学的洞察力来推动广泛且令人兴奋的应用领域新发现。我们预计5-碱基解决方案将于2026年初上市。
图8：多组学见解提高了分辨率并助力研究发现
（A）基因组和甲基化组的同步read水平报告捕获了一个等位基因上的生殖系等位基因特异性甲基化。在另一个等位基因上观察到错义突变和甲基化缺失，这些标记仅通过标准WGS是无法分辨的。（B）使用5-碱基技术处理罕见病受试者的DNA样本。通过Illumina DRAGEN生殖系分析进行的小变异检测识别出一个KMT2D突变。 甲基化数据通过EpiSign开发的表观遗传疾病分类器算法处理。综合来看，该突变和表观遗传学特征将该病归类为Kabuki综合征。