Perturb-Seq是一种高通量方法，它将成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）扰动的精确性与单细胞RNA测序（scRNA-Seq）相结合。该技术用于在单细胞分辨率下研究遗传扰动对全转录组的影响，探究基因调控网络（GRN）及细胞应答机制，从而为人类健康与疾病研究提供深入见解1。
过去，scRNA-Seq的成本和工作流程限制了Perturb-Seq的研究规模与通量。这些瓶颈尤其影响了对GRN的图谱构建 — 而这正是遗传变异与人类特征之间机制联系的关键。虽然单细胞转录组学能提供高分辨率的转录状态读数，但仅凭观察性数据难以推断因果调控关系2，3。
全基因组规模的Perturb-Seq筛查可通过引入靶向基因扰动来解决这些局限，帮助研究者鉴定基因功能、确立因果调控关系，并获得功能基因组层面的见解。为突破传统通量与工作流程的障碍，因美纳推出了新一代测序（NGS）解决方案，以支持高通量Perturb-Seq实验的实施。
高通量Perturb-Seq实验遵循一套工作流程：利用基于CRISPR的筛查技术，在细胞群体中同时敲除数个乃至数千个基因。常见的CRISPR筛查类型包括CRISPR干扰、用于基因敲除的CRISPR-Cas9以及CRISPR激活。在完成基于CRISPR的筛查后，细胞需经过进一步处理用于制备单细胞文库3。随后，文库将在诸如NovaSeq™ X系列等高通量测序仪上进行测序，并通过单细胞分析流程对数据进行分析。
传统的混池式CRISPR筛查在研究一维表型（包括细胞存活率和适应度读数）方面表现出色，而Perturb-Seq则能捕获单个细胞的全基因组表达谱。Perturb-Seq实验所获得的高维度转录组特征提供了更高的表型分辨率，并为绘制基因调控网络提供了可能3，4。
| 特征 | 传统混池式CRISPR筛查 | Perturb-Seq |
|---|---|---|
| 表型读数 | 低维度读数，基于少量预定义标志物，提供细胞活力（存活率）、增殖率（适应度）或荧光激活细胞分选（FACS）信息 | 高维度读数，scRNA-Seq通过捕获全转录组特征拓展了传统混池式CRISPR筛查的范围 |
| 数据分辨率 | 批量细胞群的平均值，掩盖了细胞间的异质性 | 单细胞分辨率，可提供转录状态的详细图谱分析 |
| 主要输出指标 | 单向导RNA（sgRNA）的富集或耗竭（例如活力或适应度评分） | 每次基因扰动引发的转录组变化及差异基因表达 |
| 主要应用 | 示例包括：发现原代细胞存活通路、必需基因以及耐药机制 | 示例包括：绘制基因GRN、识别潜在药物靶点，以及在转录组层面揭示上位相互作用 |
| 规模和通量概况 | 在一次批量运行中可扩展至大型全基因组筛查（约50–100K sgRNA） | 历史上多为靶向筛查，但随着新兴多组学和基于探针的工作流程发展，正逐步扩展至全基因组筛查能力 |
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过去，成本和工作流程的限制使得scRNA-Seq难以大规模实施。Broad Clinical Labs首席运营官Sheila Dodge将分享如何将Perturb-Seq规模化，在5天内完成500万个细胞的分析，敬请聆听她的介绍。
两者均为将基因扰动与转录组读数相关联的单细胞CRISPR技术。CRISPR液滴测序（CROP-Seq）与Perturb-Seq的主要区别在于载体设计，以及测序过程中如何捕获和识别向导RNA。
早期的Perturb-Seq载体包含一个用于测序的间接条形码，但由于可能发生慢病毒重组错误，导致条形码与向导RNA分离，因此存在局限性。CROP-Seq通过将向导RNA与转录组直接关联，解决了这一问题，规避了潜在的重组错误。如今，原始的间接捕获方法已被淘汰，现代Perturb-Seq检测主要采用直接捕获载体5。
了解更多有关CRISPR基因组编辑中的NGS和scRNA-Seq™的优势信息。
传统上，基于液滴的单细胞工作流程及相关兼容CRISPR的单细胞RNA制备试剂盒为科研人员提供了Perturb-Seq选择方案。然而，scRNA-Seq的成本与工作流程限制，制约了这些实验的通量与规模6。此外，平台适用性取决于几个因素，包括筛查规模、测序深度要求、成本限制以及其他考量。
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Perturb-Seq数据分析流程通常包含以下步骤：
1.比对与分配：将原始测序read处理成可用的量化数据，用以识别单细胞转录组，并确定对每个细胞进行编辑的特定CRISPR gRNA。
2.质量控制：进行严格过滤，去除多重细胞、空液滴以及负责编辑所需的特定CRISPR gRNA不明确的细胞。
3.表型分析：根据基因扰动对细胞进行分组，并进行差异基因表达和聚类分析，最终揭示每次编辑如何改变细胞功能7。
测序深度要求取决于多种因素，包括实验设计、转录组复杂性和扰动效率。对于Perturb-Seq实验，建议的测序深度范围为每细胞数万到超过10万条read，具体取决于实际需求。
可以，Perturb-Seq可以进行全基因组筛查。直接捕获单细胞测序化学和高通量测序仪技术的进步，有助于突破过去限制Perturb-Seq在基因组规模研究中应用的通量和成本瓶颈7。
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