TruPath™实现长片段、准确单倍型定相分析

简介

准确的单倍型定相分析对于加深我们对遗传因素如何影响人类健康和疾病的理解至关重要¹。例如，复合杂合子在同一基因内携带两个不同的致病变异。某些基因与常染色体隐性疾病相关，包括性发育障碍、先天性心脏病和癌症²。在这些基因中，如果两个致病变异位于基因的不同拷贝上（反式，trans），即足以引发表型表达。此外，单倍型定相分析对于确定等位基因特异性表达至关重要，这可能会影响人类健康（例如，CHGA中的某些单倍型会影响高血压性肾病风险）³。此外，生成单倍型解析组装可提高结构变异检测能力，并有助于分析基因组中具有医学重要性的高度多态性区域，从而促进精准医疗的发展⁴。

虽然纯合位点不存在差异，因此无法确定每个等位基因的亲本来源，而存在交替等位基因的杂合位点则可据此相互解析定相（图1A）。从单条亲本染色体上作为一个单元遗传的一组遗传变异，称为单倍型。共同遗传的交替等位基因呈顺式（cis）排列，而定位到不同染色体的交替等位基因则呈反式（trans）排列。

基于read的定相可通过分析跨越一个以上杂合变异的测序read来推断单倍型。相区块是由测序read组装而成的链，其中杂合变异被可靠地定相在一起（图1B）⁵。理想情况下，定相会为每条染色体生成一个相区块，并确定所有杂合变异之间的相位关系。然而，在实践中，当测序数据缺失或相互矛盾时，相区块无法连接。此外，即使在位于同一相区块上的基因内，也并非所有杂合变异都能被定相。有些变异缺乏覆盖度，而另一些变异则会因变异类型或检出质量而被排除。总体而言，变异定相质量可能受到定相错误、相区块长度和连续性等因素的影响，如表1所述。

TruPath™ Genome6,7的邻位映射读取技术为使用短读长测序进行基于read的定相提供了一种新颖的方法。来自同一DNA片段的read因其邻近性而被归为一组，即使没有单个read同时跨越两个位点，也能连接杂合变异。这种邻近连接为杂合位点共同取样创造了更多机会，从而提高了共定相的可能性。我们将TruPath Genome与来自长读长平台Pacific Biosciences（PacBio）和Oxford Nanopore（ONT）的公开发布供应商数据进行了比较，评估涵盖了一套全面的定相质量指标。

定相指标

定相质量的全面评估具有多维度特征（图2）。本文考虑的定相质量四个维度为：

• 完整性——分配至单倍型的杂合变异百分比
• 连续性——不中断相区块的长度
• 基因覆盖度——完全且正确定相的基因比例
• 准确性——单倍型分配错误率

定相性能比较

直接进行跨平台比较面临多项挑战，包括读长分布、错误谱和下游定相流程的差异。在本次比较中，只有一个样本（HG002）具有公开发布的因美纳（ICA, BaseSpace), PacBio (FTP链接),和ONT (FTP链接)数据。需要注意的是，数据输入未做深度归一化处理。每个平台均使用供应商推荐配置进行评估；TruPath Genome结果使用DRAGEN 4.5生成。仅考虑小变异定相，包括单核苷酸多态性（SNP）和插入缺失变异。在可行情况下，使用WhatsHap⁵评估定相性能，并辅以一款内部开发的工具，该工具扩展了现有WhatsHap指标并引入了新的指标。

完整性、准确性以及正确定相杂合变异的百分比

完整性以已定相杂合变异的百分比衡量，TruPath Genome的完整性更高（图3）。TruPath Genome和PacBio的已定相杂合变异总体百分比相近，分别为99.0%和98.1%，而ONT的已定相变异比例为75.2%。尽管ONT的已定相杂合SNP百分比较高，但其未对插入缺失变异进行定相。

连续性

尽管使用短读长测序，TruPath Genome在本分析中生成的相区块相对更长，中位NG50为7.0 Mb；相比之下，PacBio和ONT分别为0.8 Mb和1.3 Mb（图4A）。与此一致，TruPath的中位D80为1.3 Mb，而PacBio为228 kb。当同时考虑SNP和插入缺失变异时，无法计算ONT的D80，因为未定相的插入缺失变异使其在每个测量距离上的定相产量均低于80%（图4B）。当分析仅限于SNP时，TruPath Genome、PacBio和ONT的D80分别为1.3 Mb、231 kb和274 kb（图4C）。

准确性

错误率是确定定相准确性的重要测量指标。错误包括转换、翻转和转换-翻转错误（图6A）。在TruPath Genome、PacBio和ONT的比较中，所有平台的中位转换/翻转错误率和非翻转转换错误率均<0.1%（图6B和图6C）。

基因维度

如图7A所示，使用TruPath Genome时，绝大多数（98.1%）基因被完全定相，高于PacBio（83.9%）和ONT（87.9%）。在考虑基因内共定相杂合配对百分比（图7B）以及这些配对中正确定相百分比（图7C）时，TruPath Genome的数值（97.7%和97.6%）高于PacBio（81.7%和82.3%）以及ONT（63.3%和67.6%）。

TruPath Genome在标准DNA起始量条件下的性能

需要注意的是，上述所有分析均使用高分子量（HMW）DNA。与标准DNA分离相比，HMW DNA提取更费时且成本更高，并非所有实验室都具备相关条件。由于TruPath Genome依赖邻位读取映射，使用标准分子量DNA也能成功进行定相。在本文评估的数据集中，TruPath的标准提取在完整性和连续性方面与传统的长读长测序技术相近（图8A、8B和8C）。尽管使用标准分子量DNA时错误率较高，但二者的转换/翻转和非翻转转换错误率均<0.5%（图9A和9B）。

结论与未来方向

TruPath Genome于2026年初推出，让用户可以使用短读长测序执行长片段定相。采用覆盖定相质量四个维度的指标进行评估，结果表明，在本分析中，TruPath Genome在完整性、连续性和基因覆盖度方面高于市售长片段测序平台，同时可保持相近的准确性。

TruPath Genome是一种采用创新信息学流程的新型检测技术，检测能力将随产品迭代不断提升。未来的DRAGEN™软件版本旨在改善四个指标维度的定相性能，并扩展支持定相的变异类型范围。

仅供研究使用，不得用于诊断。

参考文献

1. Tewhey R, Bansal V, Torkamani A, Topol EJ, Schork NJ. The importance of phase information for human genomics. Nat Rev Genet. Mar 2011;12(3):215-23. doi:10.1038/nrg2950
2. Miller DB, Piccolo SR. A Survey of Compound Heterozygous Variants in Pediatric Cancers and Structural Birth Defects. Original Research. Frontiers in Genetics. 2021-March-22 2021;Volume 12 - 2021. doi:10.3389/fgene.2021.640242
3. Chen Y, Rao F, Wen G, et al. Naturally occurring genetic variants in human chromogranin A (CHGA) associated with hypertension as well as hypertensive renal disease. Cell Mol Neurobiol. Nov 2010;30(8):1395-400. doi:10.1007/s10571-010-9600-2
4. Garg S, Fungtammasan A, Carroll A, et al. Chromosome-scale, haplotype-resolved assembly of human genomes. Nat Biotechnol. Mar 2021;39(3):309-312. doi:10.1038/s41587-020-0711-0
5. Martin M, Patterson M, Garg S, et al. WhatsHap: fast and accurate read-based phasing. openRxiv; 2016.
6. Illumina. Introducing constellation mapped read technology. Genomics Research Hub blog. 2024. https://www.illumina.com/science/genomics-research/articles/constellation-mapped-read-technology.html
7. Illumina. Informatics advances reveal the TruPath™ Genome towards comprehensive genomic insights. GENOMICS RESEARCH HUB blog. 2026. https://www.illumina.com/science/genomics-research/articles/informatics-advances-reveal-the-trupath-genome-towards-comprehen.html