新一代测序和桑格测序的主要差别

了解什么时候使用NGS更有效

从原理上说,桑格测序与新一代测序(NGS)技术背后的概念是相似的。在NGS和桑格测序(也称为双脱氧测序或毛细管电泳测序)的过程中,DNA聚合酶会将有荧光的核苷酸逐个添加到正在延长的DNA模板链上。通过荧光标记识别每个掺入的核苷酸。

桑格测序与NGS的主要差异在于测序量。桑格测序一次只能对一条DNA片段进行测序,而NGS可以进行大规模平行测序,每次运行可同时对数百万个片段进行测序。这意味着这样的高通量过程一次可对数百到数千个基因进行测序。NGS还具有更强的探索能力,可以通过深度测序检测新型或罕见变异。

新一代测序和桑格测序的差别

NGS的优势包括:

  • 更高的灵敏度,可检测低频变异1,2
  • 周转时间更快,可检测的样本量更高3
  • 全面覆盖整个基因组
  • 检测限更低4,5
  • 可进行样本多重分析,通量更高
  • 能够同时测序数百到数千个基因或基因区域
如何选择NGS与桑格测序

了解每种方法的优点与局限性,选择最适合您的方法。

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 桑格测序靶向NGS
优势
  • 对少量靶点(1–20个)的测序快速经济
  • 流程熟悉
  • 更高的测序深度带来更高的灵敏度(低至1%)
  • 探索能力更强*
  • 突变分辨率更高
  • 相同的DNA起始量产生更多的数据
  • 样本通量更高
挑战

  • 灵敏度低(检测限约为15–20%)
  • 探索能力弱
  • 在测序大量靶点时不够经济(>20个)
  • 可扩展性低,样本起始量要求高
  • 对少量靶点(1–20个)的测序不够经济
  • 对少量靶点(1–20个)的测序不够快速

* 探索能力为鉴定新型变异的能力。
突变分辨率是指鉴定的突变大小。NGS可以进行大的染色体重排到单核苷酸变异的鉴定。
10 ng DNA用于桑格测序将产生~ 1 kb,用于靶向重测序将产生~ 300 kb(利用TruSeq Custom Amplicon流程,250 bp的扩增子长度 × 1536个扩增子)

如何选择桑格测序和新一代测序

对少量样本或少量基因组靶点(≤20个)的小DNA区域进行测序时,桑格测序是一个很好的选择。其他情况下则靶向NGS更能满足您的需求。NGS可让您经济有效地筛查更多的样本,检测基因组目标区域的多个变异——如果使用桑格测序开展这些分析则昂贵且耗时。

靶向NGS相较于桑格测序的成本效益
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参考文献
  1. Jamuar SS, Lam AT, Kircher M, et al.Somatic mutations in cerebral cortical malformations.N Engl J Med.2014;371(8):733-743.
  2. Rivas MA, Beaudoin M, Gardet A, et al.Deep resequencing of GWAS loci identifies independent low-frequency variants associated with inflammatory bowel disease.Nat Genet.2011;43(11):1066-1073.
  3. König K, Peifer M, Fassunke J, et al.Implementation of amplicon parallel sequencing leads to improvement of diagnosis and therapy of lung cancer patients.J Thorac Oncol.2015;10(7):1049-1057.
  4. Shendure J and Ji H. Next-generation DNA sequencing.Nat Biotechnol.2008;26(10):1135-1145.
  5. Schuster SC.Next-generation sequencing transforms today’s biology.Nat Methods.2008;5(1):16-18.