最小化多重分析运行的标签跳跃

避免标签交换相关的测序read错误比对的诀窍和最佳操作

最小化标签跳跃的最佳操作

新一代测序(NGS)技术的进展显著地提高了测序速度和数据产出,实现了当前测序平台的大规模样本通量。提高容量的关键是多重分析,它在文库制备过程中给每个DNA片段增加名为“标签”的独特序列。多重分析允许大量温控合并起来,在单个测序运行中同时测序。

多重分析的通量增加,复杂程度也随之增加,因为在最终数据分析前,混合文库的测序read需要在名为“多重分离”的流程中进行鉴别和分类计算。但是,有了多重分析,无论使用何种文库制备方法或测序系统,都存在标签跳跃的可能性。标签跳跃可能会导致在多重分离过程中测序read比对到错误的标签,造成错比对。

标签跳跃效应和化解策略

了解标签跳跃的主要水平及其对应用的下游效应。

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标签跳跃或者标签交换是一种已知现象,从样本多重分析开发以来就对NGS技术产生影响1。它造成特定类型的错比对,导致文库未能比对到预期标签而是错误地比对到(多重分析库的)另一个标签。

在使用了排除扩增测序化学的图案化流动槽的仪器上可以看到标签跳跃水平略高于未使用图案化流动槽的仪器。文库的自由接头序列水平越高,标签跳跃水平也更高。

自由接头序列提高了标签跳跃率
标签错比对效应白皮书

标签错比对效应

了解其发生的原因以及降低标签跳跃影响的最佳操作。

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虽然可能发生标签跳跃,但它对大多数应用的影响有限,背景跳跃read可作为噪音被筛除。图案化流动槽系统的典型标签跳跃水平范围为0.1%-2%,取决于文库的类型、质量和处理方式。利用唯一的双重标签组合从下游分析中排除跳跃read,因为预期外的组合会被标记为未确定。

按文库类型分类的标签跳跃

为让标签跳跃的水平和效应最低,客户应遵照这些最佳的文库制备操作方法:

  • 从制备文库中除去自由接头序列
  • 将文库单独保存在-20°C
  • 测序前合并文库
  • 使用唯一的双重标签合并组合(唯一的i5和i7标签)
4-plex PCR-Free文库的标签跳跃率

Illumina正在扩大唯一双重标签的数量。新标签会定期发布,首先发布的是24-plex标签,后续会增加到96-plex。研究人员可以通过唯一双重标签移除预期外的组合,只集中于有正确标签组合的“真正”数据。

下述试剂盒与新的唯一双重标签试剂盒兼容:

Illumina还在开发有助于降低文库中自由接头序列水平的酶相关解决方案。这一步骤在文库生成后进行,进一步降低标签跳跃水平。

更多详情,请参见如下资源:

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